產(chǎn)品名稱：TBD全血單個(gè)核細(xì)胞分離液 內(nèi)毒素<0.12EU

產(chǎn)品品牌：天津?yàn)?TBD

儲(chǔ)存：常溫保存，有效期2年。啟封后置常溫保存

貨號(hào)                      規(guī)格          

LDS10750125    200mL   

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

1.適用儀器

最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)。

（離心機(jī)使用時(shí)調(diào)整為慢升慢降（具體參數(shù)請(qǐng)咨詢離心機(jī)廠家）建議升速（指開始啟動(dòng)→達(dá) 到設(shè)定離心力）的時(shí)間、降速（指設(shè)定離心時(shí)間完成→機(jī)器停止）時(shí)間均控制在 3 分鐘 左右。）

2. 抗凝劑的選擇 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采血時(shí)，很多實(shí)驗(yàn)者選擇醫(yī)用真空采xue管獲得抗凝血，醫(yī)用采xue管中的抗凝劑只考慮血漿質(zhì)量，但不利于高純度細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)（或必須使用枸櫞·酸鈉的醫(yī)用真空抗凝采xue管）

為此，天津?yàn)筇貏e開發(fā)出抗凝劑及抗凝管專用于細(xì)胞分離，改變使用普通采xue管 獲得抗凝血分離效果不佳，提取率及純度低下的不良結(jié)果。

分離出的 PBMC 需要進(jìn)行下一步細(xì)胞培養(yǎng)（如培養(yǎng) NK、CIK 細(xì)胞）：選擇肝素抗凝劑。

由于血漿中的纖維蛋白原活化成有活性的纖維蛋白，纖維蛋白交聯(lián)成纖維蛋白血凝塊， 易使  PBMC    形成細(xì)胞團(tuán)塊，不利于細(xì)胞的活化。肝素Na抗凝劑可減輕上述情況發(fā)生幾率。 分離出的  PBMC    無(wú)需培養(yǎng)，而是用于其他檢測(cè)：選擇枸櫞·酸鈉抗凝劑，分離效果佳。

3. PBMC 最佳分離時(shí)間

血液離體后 2 小時(shí)內(nèi)。如達(dá)不到 2 小時(shí)內(nèi)分血條件，請(qǐng)務(wù)必于 4 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分血步驟，超過 4 小時(shí)很難順利進(jìn)行分離。

4. 分離液的使用環(huán)境

a. 分離液需常溫（37℃-15℃）避光保存，嚴(yán)禁冷藏冷凍保存；

b. 使用時(shí)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范（超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)），并在 18℃-22℃環(huán)境溫 度下進(jìn)行操作，20℃條件下分離效果佳。超出此溫度范圍，有可能使分離液密度發(fā)生 改變，造成分離效果不佳。

5. PBMC 高效離心管（詳見 PBMC 高效離心管使用說明）

6. 參考值（目的細(xì)胞參考范圍）

本試劑可保證目的細(xì)胞的提取率大于 80%，不是純度。如需獲得高純度目的細(xì)胞，請(qǐng) 配合免疫磁珠分選。本試劑盒可減少磁珠的使用量，減少成本。

【檢驗(yàn)方法】

全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃（試劑需要復(fù)溫。夏季 20℃， 冬季 23℃。）的條件下進(jìn)行。

血液樣本需要稀釋時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：

稀釋方法：1 份的 PBS 或樣本稀·釋液(產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119 需另購(gòu))加 2 份的血液進(jìn)行稀釋

（PBS:抗凝血＝1:2）； 注：稀釋液要求：用不含鈣鎂離子的緩沖液或培養(yǎng)基進(jìn)行血液稀釋。

稀釋圖例

各種規(guī)格離心管的使用方法（推薦最佳方法）

取一支無(wú)菌離心管，加入分離液，后緩慢加入血液樣本或新鮮抗凝血。血液樣本或 新鮮抗凝血小心加于分離液液界面之上。（若采血量較少，需小量分離，分離液的量不 得少于 3ml，抗凝血量在 0.2-3ml 之間）

1.15ml 離心管（包括高效離心管）：

A. 最佳比例：5ml 分離液+ 4ml 稀釋過的血液；

B. 最佳離心條件：20℃環(huán)境下，500g 離心 25min。

2.50ml 離心管（包括高效離心管）：

A. 最佳比例：20ml 分離液+ 20ml 稀釋過的血液；

B. 最佳離心條件：20℃環(huán)境下，650g 離心 30min。

未經(jīng)稀釋的抗凝血分離方法（細(xì)胞培養(yǎng)、或需保存血漿推薦用此方法）： 3.使用 15ml 離心管（或 15ml 高效離心管）：

A. 15ml 普通離心管最佳比例：5ml 分離液+ 5ml 抗凝血；

B. 15ml 高效離心管最佳比例：4ml 分離液+ 5ml 抗凝血； C. 最佳離心條件：20℃環(huán)境下，600g 離心 25min。

注：獲得純度較高的血漿：離心后，吸取血漿層由上至下的 2/3 處血漿，下 1/3 處血漿可能 包含部分 PBMC 及少量分離液成分；

4.使用 50ml 離心管（或 50ml 高效離心管）：

A. 50ml 普通離心管最佳比例：20ml 分離液+ 20ml 抗凝血；

B. 50ml 高效離心管最佳比例：15ml 分離液+ 20ml 抗凝血；

C. 最佳離心條件：20℃環(huán)境下，600g 離心 30min。

注：獲得純度較高的血漿：離心后，吸取血漿層由上至下的 2/3 處血漿，下 1/3 處血漿可能 包含部分 PBMC 及少量分離液成分。

實(shí)驗(yàn)后續(xù)方案

1. 離心后，離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色（人）單 個(gè)核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

2. ①小心吸取血漿層轉(zhuǎn)移到新離心管 A 中。

②小心吸取離心管中的環(huán)狀乳白色（人）單個(gè)核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管  B 中。

3. 向含有（人）單個(gè)核細(xì)胞的離心管 B 中，加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118 需 另購(gòu)），混勻細(xì)胞。

4. 250g，離心 10min。棄去上清。

5. 用吸管吸取 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118 需另購(gòu)）重懸所得細(xì)胞。

6. 250g，離心 10min，棄去上清。

重復(fù)清洗兩次，棄去上清，用 0.5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118 需另購(gòu)）或根據(jù)下一步 實(shí)驗(yàn)要求加入相對(duì)應(yīng)液體，重懸所得細(xì)胞。

分離圖例

【分離過程中可能出現(xiàn)的情況及處理方案】

情況一：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞層混雜紅細(xì)胞

1.  吸取有紅細(xì)胞混雜的單個(gè)核細(xì)胞層。

2.  取 15 毫升離心管加入紅細(xì)胞混雜的單個(gè)核細(xì)胞層，根據(jù)紅細(xì)胞殘余數(shù)量酌情加入 5-8倍紅細(xì)胞裂解液。

a.  如有紅細(xì)胞混雜則加入適量紅細(xì)胞裂解液（產(chǎn)品編號(hào)：NH4CL2009   需另購(gòu)）將紅細(xì)胞裂 解（具體方法見“紅細(xì)胞裂解液使用說明"）即得目的細(xì)胞。

b. 參考紅細(xì)胞裂解液說明書操作。少時(shí)多次裂解后獲得單個(gè)核細(xì)胞。

【注意事項(xiàng)】

1. 關(guān)于血液分離液效果討論。

A. 臍帶血：臍帶血收集到細(xì)胞分離時(shí)長(zhǎng)一般大于 2 小時(shí)，冷藏存放與運(yùn)輸在所難免。與 外周血靜脈采血相比，大多臍帶血分離效果較差，為此，灝洋專門開發(fā)了臍帶血單個(gè)核細(xì)胞分離液。

B. 血液個(gè)例：每個(gè)人都是一個(gè)單獨(dú)個(gè)體，血液也有差異。例如：疾病、藥物、性別、身 體狀況、經(jīng)期等等?？赡艹霈F(xiàn)分離效果較差，目前原因不明確。

C. 案例：應(yīng)用過免疫動(dòng)員劑類藥物，普通的樣本密度分離液分離效果較差，有大量的粒 細(xì)胞混雜，不能使用。天津?yàn)鬄榭蛻舳ㄖ埔豢顚Ｓ玫臉颖久芏确蛛x液，PBMC 的提取 率大大提高，純度提高了 50％以上，得到客戶的認(rèn)可，歡迎廣大醫(yī)療及科研用戶致電華雅思創(chuàng)客服 咨詢。

2. 本實(shí)驗(yàn)最好不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì) 變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

3. 吸取過多的單個(gè)核細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的 粒細(xì)胞數(shù)量增加。

4. 吸取過多的單個(gè)核細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

5. 不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞?huì)降低細(xì)胞得率及活性。稀釋液要求：不含鈣鎂離子的緩沖液或培養(yǎng)基。 血液樣本經(jīng)過稀釋則分離過程中需適當(dāng)降低離心力和離心時(shí)間。

6. 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

常溫保存，有效期  2    年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如   4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】 本實(shí)驗(yàn)單個(gè)核細(xì)胞提取率大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【可能存在的問題及解決方法】

1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

2. 離心機(jī)離心力、轉(zhuǎn)速、半徑的換算方法

3. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離 心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

4. 本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完·全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以  50-100g    為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果， 離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。

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